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選擇合適的蛋白表達(dá)系統(tǒng)是重組蛋白成功表達(dá)的關(guān)鍵

更新時(shí)間:2022-10-31   點(diǎn)擊次數(shù):1255次
  重組蛋白表達(dá)是將目的基因通過電轉(zhuǎn)化或者熱激等手段轉(zhuǎn)入合適的宿主中,利用宿主的特定生理、生化和遺傳特點(diǎn)進(jìn)行目標(biāo)蛋白大量表達(dá)及純化的生物技術(shù)。這些目標(biāo)蛋白從來源上可分為病毒蛋白、細(xì)菌蛋白、真菌蛋白、植物蛋白以及動(dòng)物蛋白等;從功能上可區(qū)分為酶、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、離子通道以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。另外,從理化性質(zhì)上可區(qū)分為膜蛋白、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血紅素蛋白以及金屬蛋白等。
  選擇合適的蛋白表達(dá)系統(tǒng)是重組蛋白成功表達(dá)的關(guān)鍵。需要考慮以下方面的因素,包括:目標(biāo)蛋白性質(zhì)、用途、蛋白質(zhì)產(chǎn)量和成本。此外,許多蛋白質(zhì)表達(dá)項(xiàng)目也存在著風(fēng)險(xiǎn),尤其是大蛋白、膜蛋白、核蛋白和具有大量翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。
  1.原核表達(dá)系統(tǒng)
  大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最主要也是成熟的表達(dá)系統(tǒng)。主要方法是將目標(biāo)DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞。然后用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
  大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為最早開發(fā)和應(yīng)用廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng),具有遺傳背景清晰、選育快、成本低、表達(dá)量高、產(chǎn)品純化容易、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。然而,在原核表達(dá)系統(tǒng)中也存在許多缺點(diǎn):例如并非所有的蛋白質(zhì)都是可溶的。細(xì)胞質(zhì)中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)能形成稱為包涵體的不溶性聚集物,這導(dǎo)致了蛋白難以純化。此外,原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后修飾過程不完善,表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。
  因此,其他更復(fù)雜的系統(tǒng)也正在開發(fā)中;這些系統(tǒng)可能允許以前認(rèn)為在大腸桿菌中不可能表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá),例如糖基化蛋白質(zhì)。
  2.酵母表達(dá)系統(tǒng)
  酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種新的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng),具有原核和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。它在基因工程領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。1996年對(duì)釀酒酵母全基因序列進(jìn)行了測序。釀酒和面包行業(yè)使用釀酒酵母已有數(shù)千年的歷史,被認(rèn)為是不產(chǎn)生毒素的GRAS(一般*為安全的)生物,也被FDA認(rèn)可。因此,酵母系統(tǒng)表達(dá)的產(chǎn)物不需要進(jìn)行大量的宿主安全性實(shí)驗(yàn)。然而,與新的酵母系統(tǒng)相比,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)不適合于高密度培養(yǎng),缺乏強(qiáng)有力和嚴(yán)格的調(diào)控啟動(dòng)子。分泌效率低。尤其是分子量大于30kD的許多靶蛋白幾乎不分泌。
  后來,人們開發(fā)了裂變酵母和甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)。其中,甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前,甲醇酵母主要有H多晶型、博迪念珠菌和畢赤酵母。大多數(shù)甲醇酵母含有甲醇酵母氧化酶基因-1(AOX1),外源基因在啟動(dòng)子(paox1)作用下表達(dá),PAOX1是以葡萄糖或甘油為碳源的強(qiáng)啟動(dòng)子,AOX1基因在甲醇酵母中的表達(dá)通常受到抑制。當(dāng)甲醇為碳源時(shí),PAOX1可以被活化,因此,在該基因的控制下,AOX1基因的表達(dá)可以增加。利用甲醇酵母來表達(dá)外源蛋白的產(chǎn)量通??蛇_(dá)到克級(jí)別。與釀酒酵母相比,其翻譯更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞,不發(fā)生高糖基化。

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