文章標題：Identification of plasma miR-4505, miR-4743-5p and miR-4750-3p as novel diagnostic biomarkers for coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a case-control study
發(fā)表年限：2024年
期刊：Cardiovascular Diabetology
影響因子：8.5
研究背景
2 型糖尿病（T2DM）和冠狀動脈疾?。–AD）是常見的共存臨床疾病，在全球范圍內的發(fā)病率仍在增長。最近，循環(huán)RNA（miRNA）已成為心臟代謝疾病中的新型分子參與者。本研究旨在確定特異性 miRNA 特征作為 T2DM 中 CAD 的候選生物標志物，并描繪導致糖尿病動脈粥樣硬化的潛在 miRNA 依賴性機制。
研究方法
共收集來自患有和不患有 CAD 的 T2DM 患者、CAD 患者和健康對照的 38 份血漿樣品，使用微陣列對 2,578 個 miRNAs 進行表達譜分析。為了研究差異表達 （DE）-miRNA 靶基因的調控作用，利用多種生物信息學工具進行了功能注釋和通路富集分析。然后，利用 Cytoscape 軟件中的 STRING 數(shù)據(jù)庫建立蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡，進行聚類分析和樞紐基因鑒定。在 94 名參與者的較大復制隊列中進行逆轉錄定量實時聚合酶鏈反應 （RT-qPCR） 以驗證微陣列數(shù)據(jù)。采用受試者工作特征分析評價 miRNAs 的診斷價值。采用多因素 logistic 回歸分析開發(fā)基于 miRNA 的診斷模型。
本文中通過Cytoscape v3.10.0 軟件中的STRING數(shù)據(jù)庫插件（stringApp v2.0.1）進行蛋白質互作網(wǎng)絡構建，來確定已驗證的差異miRNA在T2DM-CAD中的調控作用，綜合置信度得分大于0.4的相互作用被保留。然后使用Cytoscape v3.10.0軟件中的分子復合物檢測（MCODE v2.0.3）插件來于深入了解PPI網(wǎng)絡中可能緊密連接的基因模塊（簇、子網(wǎng)絡），并進行富集分析（Figure 1）。通過Cytoscape v3.10.0 軟件中的 CytoHubba 插件過濾PPI網(wǎng)絡，找到關鍵中心基因（Figure 2）。
Figure 1：
Figure 2：
Cytoscape是一個開源的軟件平臺，用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡和生物途徑，適用于復雜網(wǎng)絡分析，同時也具有很多實用性的插件。今天我們來一起用軟件和插件，按文章中的邏輯和操作步驟，來畫一個蛋白質互作網(wǎng)絡圖。
Cytoscape在windows平臺只有64位版本在Cytoscape獲取最新下載地址，請注意，Cytoscape安裝需要配套的Java運行環(huán)境，所以需要先安裝Java，安裝好后再進行Cytoscape的安裝，根據(jù)安裝提示進行下一步即可。
安裝Java后，需要配置環(huán)境變量，在電腦開始菜單搜索“編輯系統(tǒng)環(huán)境變量"（win 11），點擊環(huán)境變量：
新建系統(tǒng)變量，變量名輸入JAVA_HOME，變量值輸入Java安裝路徑，點擊確定保存：
編輯Path環(huán)境變量，新建一行輸入Java路徑，點擊確定保存即可完成環(huán)境變量配置。
開始菜單輸入cmd，繼續(xù)輸入java -version查看是否安裝成功，Java版本：
這里我們安裝的Cytoscape版本是3.10.3，Java版本為17.0.13，安裝好后我們來了解一些基礎功能。
打開Cytoscape后，啟動面板可以大致分為以下幾部分內容：
1.菜單
●File：文件菜單?？梢赃M行文件的導入和輸出，常用選項有：
? Import：導入網(wǎng)絡或表格。
? Export：導出網(wǎng)絡圖片或表格，也可導出為網(wǎng)頁。
? Open Session / Open Recent Session：可以打開 Cytoscape 文件或列出最近打開的會話文件，以便快速訪問。
? New Network：創(chuàng)建新網(wǎng)絡，可以編輯空白網(wǎng)絡，也可以從一個現(xiàn)有網(wǎng)絡創(chuàng)建。
? Save Session：保存會話文件。
●Edit：編輯菜單?？梢赃M行撤銷重做等。撤消和重做功能適用于最近執(zhí)行的 10 個任務?？梢詫⒆⑨屜蚯?、向后以及將其推或拉到前景層和背景層，常用選項有：
? Undo/Redo：將所有已刪除的節(jié)點和邊進行恢復或重做。
? Destroy Networks/Views：刪除網(wǎng)絡或刪除現(xiàn)有的視圖，再次create view后回到初始風格狀態(tài)。
? Remove Duplicated Edges：用于刪除重復的邊（具有相同的源節(jié)點和目標節(jié)點），只保留一條邊。
? Remove Self-Loops ：用于刪除具有相同的源和目標節(jié)點的邊。
? Remove Selected Nodes and Edges：用于刪除選定的節(jié)點和邊。
●View：視圖菜單?？梢燥@示或隱藏各個窗口，也可以進行放大縮小或適配網(wǎng)絡視圖。
●Select：選擇菜單。可以選擇點或邊進行展示和隱藏。
●Layout：布局菜單?？梢允謩诱{整節(jié)點位置，也可以通過布局菜單中的預設布局算法進行網(wǎng)絡圖布局的調整，這些布局算法也可以將節(jié)點和邊的數(shù)據(jù)列考慮進去。常規(guī)布局有：
? Layout Tools：節(jié)點布局工具，可以幫助自動化或微調布局。選擇個別節(jié)點或全部節(jié)點，可以對邊的長度、方向進行調整，也可以設置節(jié)點相對位置。
? Grid Layout：網(wǎng)格布局，所有節(jié)點排列成方形網(wǎng)格。
? Hierarchical Layout：分層布局，展示網(wǎng)絡中的主要方向，節(jié)點被放置在按層次排列的層級中，通過最小化邊的交叉數(shù)量對每個層內的節(jié)點進行排序。
? Circular Layout：環(huán)形布局，強調網(wǎng)絡中的分組和樹狀結構，通過分析結構的連通性對網(wǎng)絡進行分組，并將分組結果布局成單獨的圓，圓本身以放射狀樹形布局的方式進行排列。
? Stacked Node Layout：堆疊節(jié)點布局，將節(jié)點縱向堆疊排列進行布局。
? 還有一些通過安裝插件實現(xiàn)的布局選項，根據(jù)實際效果選擇合適美觀的布局操作。
●Apps：應用菜單?？梢赃M行插件管理，為已安裝的插件提供菜單選項。常用的插件有：
? stringApp：從Cytoscape內導入string-db的蛋白質互作網(wǎng)絡。
? MCODE：對網(wǎng)路中節(jié)點和邊進行聚類分析。
? CytoHubba：過濾互作網(wǎng)絡，篩選核心基因。
? yFiles Layout Algorithms：更多網(wǎng)絡圖布局。
●Tools：工具菜單。包含多種高級功能，如下所示：
? Analyze Network：網(wǎng)絡分析，查看節(jié)點、邊、連接的數(shù)量，網(wǎng)絡直徑、半徑、聚類系數(shù)等。
? Enrichment Table：富集分析，需要有與查詢基因相關的物種及gene symbols。
? Open Web Page：可以打開瀏覽器窗口，快速查看Cytoscape特定網(wǎng)頁。在作圖時參考Cytoscape使用手冊的內容。
●Help：幫助菜單。可以查看用戶使用手冊。
? Citations：可以查看Cytoscape的主要參考文獻和已安裝插件的參考文獻。
2. 常用功能圖標
這些功能也可以通過菜單使用。將鼠標指針懸停在圖標上，短暫停留將會顯示該工具的提示信息，右擊工具欄可以自定義內容。
a.從Network Data Exchange (NDEx)中導入或導出網(wǎng)絡。
b.打開或保存網(wǎng)絡文件（.cys）。
c.從文件中導入網(wǎng)絡或導入表格，添加到目前的網(wǎng)絡中。
d.針對網(wǎng)路主視圖窗口的可視化操作，放大、縮小、適配屏幕、選擇部分節(jié)點適配屏幕。
e.恢復網(wǎng)絡的初始狀態(tài)。
f.找到選中節(jié)點的鄰近節(jié)點，可以多次點擊；隱藏選中節(jié)點和邊；顯示被隱藏的節(jié)點和邊。
g.使用選擇的節(jié)點和邊形成自網(wǎng)絡。
h.富集分析。
3. 網(wǎng)絡面板
修改節(jié)點、邊、網(wǎng)絡的樣式，包括顏色、節(jié)點大小、字體、形狀等，也可以修改網(wǎng)絡圖整體背景顏色。
4.顯示網(wǎng)絡的主網(wǎng)絡視圖窗口
顯示網(wǎng)絡圖，可以同時顯示多個網(wǎng)絡圖窗口，網(wǎng)絡視圖底部是一系列視圖工具。將鼠標指針懸停在圖標上，短暫停留將會顯示該工具的提示信息。
a.將所有已經(jīng)加載的網(wǎng)絡以網(wǎng)格樣式排列各個窗口視圖；顯示當前選擇的網(wǎng)絡。
b.獨立網(wǎng)絡視圖窗口，將網(wǎng)絡圖窗口與軟件主窗口分開。
c.導出網(wǎng)絡或網(wǎng)絡圖。
d.強制渲染圖形細節(jié)（默認關閉）；關閉或打開節(jié)點選擇；關閉或打開邊選擇；關閉或打開注釋選擇；關閉或打開節(jié)點或邊的標簽選擇。后四個選項影響你在視圖窗口中是否能選擇拖動節(jié)點、選擇邊，移動節(jié)點標簽等。
e.隱藏鳥瞰視圖。在大型網(wǎng)絡圖中方便查看每個位置的節(jié)點。
5.表格面板
顯示節(jié)點和邊的數(shù)據(jù)，可以修改相應數(shù)據(jù)。導入或導出表格，添加或刪除表，還可以篩選想要顯示的列。
6.命令面板
可以讀取和執(zhí)行腳本文件，文件中每行為發(fā)送到應用的命令。
插件可以直接在Cytoscape App Store進行搜索下載。
也可以在Cytoscape中的App Store →Show App Store中進行查找，跳轉對應插件網(wǎng)頁，相比直接的網(wǎng)頁搜索效果更精確，網(wǎng)頁搜索會將包含相應單詞的插件都顯示出來。
進入網(wǎng)頁后下載插件文件，下載好后回到Cytoscape，選擇Install Apps From File 進行安裝。這里我們安裝了stringApp、MCODE和CytoHubba，嘗試復原文獻中的蛋白互作網(wǎng)絡圖的樣式。
首先我們可以下載得到開頭文章中所用的互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)，如圖，Table 5中是作者構建的12個差異miRNA驗證靶基因的PPI網(wǎng)絡。其中，3個（hsa-miR-4505, hsa-miR-4743-5p, hsa-miR-6846-5p）上調，共341個靶基因，9 個（hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-4668-5p, hsa-miR-4706, hsa-miR-6511b-5p, hsa-miR-6750-5p, hsa-miR-4750-3p, hsa-miR-320e, hsa-miR-4717-3p, hsa-miR-7850-5p）下調，共1991個靶基因。這里我們用上調的miRNAs涉及到的靶基因進行作圖，共341個。
第一步：使用Cytoscape中的STRING數(shù)據(jù)庫，鑒定網(wǎng)絡圖存在的節(jié)點和邊。
1. 通過File→Import→Network from Public Databases，導入互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫。
2.切換至STRING：protein query，選擇對應物種，輸入靶基因列表，其余參數(shù)可以保持默認狀態(tài)，也可以根據(jù)需要自行選則。
其中Network type是指網(wǎng)絡類型，默認選擇full STRING network，指保留全部來源的互作網(wǎng)絡，既有實際證據(jù)證明的，也包含基于臨近基因、文本檢索、共表達、共定位等預測的可能存在的蛋白相互作用。 physical subnetwork則僅保留存在實質結合或形成蛋白復合體的相互作用。Confidence (score) cutoff指互作置信度篩選值，在STRING中，0.4為中等可信度，0.7為高可信度，0.9為最高可信度，0.15為較低可信度。Maximum additional interactors 指附加的互作蛋白數(shù)量最大值，最多可添加的互作數(shù)量，可以將原始查詢中未包含但預測到會發(fā)生相互作用的蛋白質添加到網(wǎng)絡中。Use Smart Delimiters可以使用只能分隔符正確分隔輸入的蛋白質名稱和標識符。Load Enrichment Data指加載富集數(shù)據(jù)對蛋白進行富集分析。
3.導入后即可獲得相應的蛋白質互作網(wǎng)絡圖，可以通過右側選項更改圖片呈現(xiàn)樣式，修改標識符位置，隱藏或顯示單獨節(jié)點，點擊任意節(jié)點可以查看對應蛋白的描述和結構。
還可以通過Tools→Analyze Network分析網(wǎng)絡，查看點和邊的數(shù)量等信息。
第二步：使用Cytoscape中的MCODE 插件，對所有節(jié)點和邊進行聚類分析。
1. 首先打開Apps→MCODE，參數(shù)一般維持默認即可。其中，F(xiàn)ind Clusters，可以從全部網(wǎng)絡圖中尋找，也可以從選定的節(jié)點和邊中尋找。Include Loops，選擇后MCODE會包含循環(huán)的邊(self-edges)。Degree Cutoff指對節(jié)點評分的最小連接數(shù)，如僅與另一個節(jié)點共享一個節(jié)點的Degree值為1，有效最小數(shù)值為2，防止單連接節(jié)點人為的獲得高節(jié)點數(shù)。Haircut，指一些滿足Degree Cutoff的節(jié)點可能僅通過一條邊連接到集群，Haircut會刪除這類單連接節(jié)點。K-Core：過濾掉不包含最少K 值的最大互連子集群的集群，子集群中的節(jié)點degree都要大于K。 Max.Depth：子節(jié)點到集群中其他節(jié)點的距離，MCODE可以在該距離內搜索集群的子節(jié)點。
分析完成后，可以把每個自網(wǎng)絡單獨輸出，進行調整。
可以通過Layout，選擇合適的布局輸出保存成圖片或文件。
第三步：使用Cytoscape中的cytoHubba 插件，過濾 PPI 網(wǎng)絡，篩選核心基因。
1.點擊左側的cytoHubba工作區(qū)，選擇目標分析網(wǎng)絡，點擊calculate，選擇關鍵基因數(shù)量排名靠前的十個，使用BottleNeck算法進行分析，或者選擇感興趣的基因。
2.核心基因結果顯示如下，右邊列表為核心基因排名，顏色越深分數(shù)越高，說明這個基因越顯著。可以通過style中的各項修改網(wǎng)絡圖樣式，這里我們修改了圖中標識的顯示內容，可以看出PTEN同文章中一樣，是上調miRNA中的關鍵核心基因。
3.同樣的，我們可以調整網(wǎng)絡圖布局進行輸出，得到如下結果：
本次Cytoscape使用介紹就到這里，更多介紹可以查看中文手冊以及相關插件的對應使用手冊。
參考文獻
[1] Szyde?ko J, Czop M, et al. Identification of plasma miR-4505, miR-4743-5p and miR-4750-3p as novel diagnostic biomarkers for coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a case-control study. Cardiovasc Diabetol. 2024;23(1):278.
[2] Locard-Paulet, Marie et al.Functional Analysis of MS-Based Proteomics Data: From Protein Groups to Networks.Molecular & Cellular Proteomics, Volume 23, Issue 12, 100871.
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